Reseq-Nanopore測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程及材料方法

1、提取方法

1.1?植物組織：CTAB法

1. 液氮研磨樣品，分裝至離心管中
2. 向離心管中加入 CTAB，水浴
3. 離心后向上清中加入氯仿/異戊醇（24:1），離心
4. 向上清中加入異丙醇和乙酸鈉溶液，離心，棄上清
5. 加入 75％乙醇，離心，棄上清
6. 晾干，加入 TE ?溶解 DNA ，保存在-20℃冰箱

1.2?動(dòng)物組織：SDS法

1. 液氮研磨組織樣，分裝至離心管中
2. 加入 SDS 溶液，水浴
3. 加入 NaCl 溶液，靜置后離心
4. 向上清中加入氯仿/異戊醇（24:1）后離心
5. 向上清中加入異丙醇后離心，棄上清
6. 加入 75％乙醇，離心，棄上清
7. 晾干，加入 TE 溶解 DNA，保存在-20℃冰箱

1.3?動(dòng)物血液：Kurabo 試劑盒法

QuickGene DNA whole blood kit S (DB-S)，廠家：Kurabo，貨號(hào)：40321300101

1.4?粗體核酸純化

試劑盒名稱：QIAGEN Genomic-tip 20/G，廠家：QIAGEN，貨號(hào)：10223

試劑盒名稱：QIAGEN Genomic-tip 100/G，廠家：QIAGEN，貨號(hào)：10243

1.5?微生物樣本

使用TGuide S96磁珠法土壤/糞便基因組DNA提取試劑盒完成核酸的提取

2、檢測(cè)方法

2.1?檢測(cè)方法

• 濃度檢測(cè)

Nanodrop：賽默飛 Thermo ，型號(hào) NANODROP2000

Qubit：廠家YEASEN, 型號(hào)CAT 12642-A ，試劑1XdsDNA HS Assay kit for Qubit

• 完整性檢測(cè)（瓊脂糖凝膠電泳）

電泳儀：廠家：天能 Tanon ，型號(hào) EPS600

電泳槽：廠家：天根生化科技（北京）有限公司，型號(hào)：HE- 120

2.2?判定標(biāo)準(zhǔn)

• 總量≥2μg（單次建庫(kù)）
• 濃度≥50ng/ul
• 體積≥10(ul)
• OD260/280在7-2.2之間，OD260/230在1.0-3.0之間
• AGE：size≥23K，降解條帶>5K，點(diǎn)樣孔無(wú)或有輕微污染，N/Q在8-2.5之間
• 樣本狀態(tài)正常，樣本粘稠、顏色異常、有渾濁或不溶物均不合格

注：特殊物種實(shí)驗(yàn)人員會(huì)根據(jù)經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行判斷，具體以檢測(cè)報(bào)告中的判斷結(jié)果為準(zhǔn)

3、建庫(kù)方法

3.1?建庫(kù)流程

1. 準(zhǔn)備高質(zhì)量核酸，g-TUBE 管使核酸片段化
2. 使用BluePippin進(jìn)行片段篩選
3. 使用 NEBNext FFPE DNA Repair Mix 和 NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module 完成核酸片段的損傷修復(fù)和末端修復(fù)加 A
4. 使用無(wú)擴(kuò)增條形碼擴(kuò)展試劑盒添加 barcode 序列
5. 使用無(wú)擴(kuò)增條形碼擴(kuò)展試劑盒完成測(cè)序接頭的連接

3.2?建庫(kù)試劑

• 文庫(kù)構(gòu)建試劑：NEBNext FFPE DNA Repair Mix貨號(hào)?M6630L 廠家?NEB
• 文庫(kù)構(gòu)建試劑：NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module貨號(hào)E7546L ?廠家NEB
• 文庫(kù)構(gòu)建試劑：無(wú)擴(kuò)增條形碼擴(kuò)展試劑盒1-96 ?貨號(hào)SQK-NBD114.96 廠家Nanopore

3.3?建庫(kù)設(shè)備

• 數(shù)字 3*32PCR 儀??廠家?Appliedbiosystems???儀器規(guī)格?proflex3*32
• 制冷型程控五段金屬浴??廠家?天根生化科技（北京）有限公司??儀器規(guī)格?OSE-DB-02

4、測(cè)序方法

4.1?上機(jī)操作

• 用測(cè)序芯片制備試劑盒配制 Flow cell Priming mix
• 用測(cè)序輔助擴(kuò)展試劑盒配置上機(jī)文庫(kù)
• 用 PromethION ?Flow ?Cells 芯片，在PromethION48測(cè)序儀運(yùn)行MinKnow 軟件，開(kāi)始測(cè)序，默認(rèn)運(yùn)行72 小時(shí)

4.2?測(cè)序試劑

• 測(cè)序芯片制備試劑盒??貨號(hào)?EXP-FLP004 ??廠家?Nanopore
• 測(cè)序輔助擴(kuò)展試劑盒??貨號(hào)?EXP-AUX003 ?廠家?Naonopore
• 測(cè)序芯片??PromethION Flow Cell(R10.4.1)??貨號(hào)?FLO-PRO114M ??廠家?Nanopore

4.3?測(cè)序設(shè)備

PromethION48 測(cè)序儀??廠家?Nanopore???儀器規(guī)格?PromethION48